научная статья по теме О ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СИСТЕМЕ СВЕТЯЩЕГОСЯ ГРИБА NEONOTHOPANUS NAMBI Математика
Текст научной статьи на тему «О ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СИСТЕМЕ СВЕТЯЩЕГОСЯ ГРИБА NEONOTHOPANUS NAMBI»
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 438, № 5, с. 705-707
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
О ЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ СИСТЕМЕ СВЕТЯЩЕГОСЯ ГРИБА
© 2011 г. В. С. Бондарь, А. П. Пузырь, К. В. Пуртов, С. Е. Медведева, Э. К. Родичева, академик И. И. Гительзон
Способностью излучать видимый свет обладают многие высшие грибы, известно около 80 светящихся видов, которые обнаружены в разных регионах земного шара (Северная и Южная Америка, Европа, Азия (в том числе Сибирь), Австралия, Африка, Бразилия) [1—3]. Однако до настоящего времени механизмы свечения высших грибов остаются малопонятными, и нет однозначного мнения о молекулярной организации их люминесцентных систем [2, 4, 5]. Дискутируются два альтернативных представления: 1) биолюминесценция грибов обеспечена классической фермент-субстратной системой люцифераза—люцифе-рин, 2) свечение вызывается окислением органических субстратов оксидазами без специализированного фермента. Наличие фунгальной люциферазы, таким образом, подвергается сомнению или вообще отрицается. Изучение этих аспектов имеет не только фундаментальное значение для полноты представлений о биолюминесценции как природном явлении, но и практическую ценность для использования светящихся грибов как биомаркёров, что существенно расширит возможности биолюминесцентной аналитики. Известно лишь несколько работ по применению светящихся грибов для биотестирования [6, 7].
Мы исследовали люминесцентную систему светящегося гриба Neonothopanus nambi, который был выявлен в тропических лесах Южного Вьетнама и первоначально описан как вид Omphalotus af. illudent [8].
В работе использовали культуру гриба N. nambi и его плодовые тела, любезно предоставленные вьетнамским исследователем Дао Тхи Ван (Dao Thi Van) (частная коллекция штаммов BIO-LUMI Co., Ltd., Ho Chi Minh City, Vietnam). Выращивание мицелия проводили в жидкой питательной картофельно-сахарозной среде (200 г картофеля, 20 г сахарозы, 1 л дистиллированной воды) при
Сибирского отделения Российской Академии наук, Красноярск
Сибирский федеральный университет, Красноярск
температуре 26°С в темноте в течение 8—10 сут. В экспериментах использовали также сухие образцы мицелия и плодовых тел гриба, полученные после их высушивания при температурах 30— 35°С до постоянной массы.
Уровень светопродукции мицелия N. nambi оценивали с помощью люминометра БЛМ 8801 (СКТБ «Наука», Красноярск, Россия), калиброванного по радиоактивному стандарту Гастингса— Вебера (одна люминесцентная единица составляет 108 фотонов в 1 с). Люминесцентные сигналы регистрировали с помощью самописца (модель 2210) фирмы «LKB» (Швеция). Для регистрации спектра люминесценции гриба использовали спектрофлуориметр (модель Aminco-Bowman, Series 2 luminescent spectrometer) фирмы «Thermo Spectronic» (США).
Для разрушения мицелия применяли растирание при 4°С в воде и буферных системах с нейтральным значением рН, предварительное замораживание мицелия при —20° С в морозильной камере и —170°С жидким азотом с последующим растиранием в керамической ступке, дезинтеграцию с помощью гомогенизатора в системе стекло—стекло, обработку образцов 5%-ным раствором тритона Х-100 для солюбилизации.
Экспериментально нами было установлено, что свежевыращенные образцы мицелия N. nambi обладают способностью длительной светопродукции (рис. 1). Видно, что помещенные в кювету люминометра образцы мицелия в начальный момент обладают невысоким уровнем свечения. С течением времени люминесценция заметно увеличивается и может существенно превышать исходный уровень. Время выхода свечения на максимальный уровень составляет от 40 мин до 5 ч. После этого уровень светопродукции снижается и выходит на стационарный уровень, который сохраняется по крайней мере в течение 10—12 ч измерений. Возможно, наблюдаемый значительный подъем светопродукции связан с восстановительными процессами, происходящими в мицелии после его механического повреждения в момент отбора образцов для анализа. Образцы свежевыращенного мицелия, помещенные в дистиллированную воду,
Рис. 1. Биолюминесценция мицелия N. nambi, полученного при культивировании в жидкой питательной картофельно-сахарозной среде, в зависимости от времени.
также способны в течение длительного времени (более двух недель) сохранять способность свето-продукции.
Мы установили, что спектр люминесценции N. nambi располагается в видимой области (диапазон длин волн 480—700 нм) с максимумом 527— 535 нм (рис. 2). Эти данные хорошо согласуются с результатами ряда авторов [4, 5, 9], полученными для других видов высших светящихся грибов. С одной стороны, это позволяет предполагать сходство, если не идентичность, молекулярной основы светящихся видов грибов, имеющих одинаковый максимум световой эмиссии, по крайней мере тех, спектр излучения которых был исследован. Однако, возможно, сходны лишь терминальные эмиттеры люминесценции у разных видов грибов подобно широко распространенному у животных с разными биолюминесцентными системами одинаковому терминальному эмиттеру — зеленому флуоресцентному белку (GFP — green fluorescent protein), открытому автором работы [10].
Люминесцентная система N. nambi является кислородзависимой. Удаление кислорода дитио-нитом натрия или его замещение газообразным азотом вызывает падение люминесценции до нулевого уровня. Последующее восстановление доступа кислорода приводит к восстановлению свечения.
Примененная нами система реагентов Фенто-на (Fe2+ и Н2О2) не оказывала стимулирующего действия на люминесцентную систему гриба. Одновременные добавки в реакционную смесь Fe2+ (1 и 4 мМ) и Н2О2 (20 мМ) не повышали уровень люминесценции. Не увеличивала светопродук-цию и добавка диэтилдитиокарбамата натрия (1 мМ) как ингибитора супероксиддисмутазы.
Рис. 2. Спектр биолюминесценции мицелия N. nambi
Исходя из этого, можно предполагать, что изучаемая люминесцентная система вероятнее всего функционирует без участия супероксид-анион-радикала. Тем не менее следует заметить, что активация люминесценции светящихся грибов P. stipti-cus, A. mellea, M. citricolor, P. japonicus, O. olearius, M. lux-coeli супероксид-анион-радикалом была показана в работах [5, 11].
Нами было обнаружено, что люминесценция мицелия N. nambi стимулируется добавками только перекиси водорода (диапазон концентраций 1—20 мМ), что может свидетельствовать об участии пероксидазы (или нескольких перокси-даз) в механизме светопродукции данного вида гриба. Эта версия представляется правомочной, поскольку известно, что многие высшие грибы содержат активно функционирующие лигнино-литические ферментные комплексы, в состав которых входит несколько ферментов, обладающих пероксидазной активностью [12, 13].
Мы установили, что ионы некоторых двухвалентных металлов влияют на люминесцентную систему N. nambi. Интенсивность люминесценции мицелия повышается в 1.5—3 раза при добавке ионов Mn (10-40 мМ). Ионы Са (5-80 мМ) практически не оказывают действия на светоиз-лучение мицелия, ионы Mg (20 мМ) понижают уровень люминесценции на 15-25%. Ионы Ni и Co при концентрации 10 мМ снижают уровень люминесценции на 25-30 и 50-60% соответственно. Добавка ЭДТА (10-20 мМ) заметно (в 2—3 раза) повышает уровень светопродукции мицелия, вероятно, за счет связывания ионов двухвалентных металлов, которые могут ингиби-ровать люминесцентную систему.
Механизм обнаруженной стимуляции люминесценции ионами марганца можно объяснить, если принять во внимание высказанную выше версию и предположить наличие в составе лигни-норазрушающего ферментного комплекса гриба
О ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СИСТЕМЕ СВЕТЯЩЕГОСЯ ГРИБА
N. nambi Mn-пероксидазы (или Mn-пероксидаз). Известно, что пероксидазный комплекс высших грибов может содержать Mn-пероксидазу и гибридную Мп-пероксидазу [14, 15]. Данное предположение требует дальнейшего исследования.
Проведенное нами механическое разрушение мицелия N. nambi приводит к необратимой утрате способности гриба светиться. При этом установлено, что момент дезинтеграции мицелия не сопровождается излучением света. Свечение гомо-генатов, полученных при разных способах дезинтеграции мицелия, не удается восстановить кислородом, добавками ионов марганца, перекиси водорода, ЭДТА, сменой буферных систем. После замораживания образцов мицелия в воде при —20°С и последующего их размораживания при комнатной температуре светоизлучающая способность гриба полностью утрачивается.
Аналогичные результаты нами были получены также с образцами мицелия и плодовых тел гриба, предварительно высушенных до постоянной массы при мягких температурных условиях (30— 35°С). Обнаружено также, что сухие образцы мицелия и плодовых тел, помещенные в воду или буферную систему с нейтральным значением рН, не восстанавливают светоизлучающую способность. Полученные результаты свидетельствуют о том, что люминесцентная система N. nambi локализована на клеточной мембране или в других клеточных структурах.
Наши экспериментальные данные показали, что экстракты, полученные после разрушения мицелия N. nambi и удаления обломков центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин (Centrifuge 5415R, Eppendorf, Германия) при 10°С, содержат активатор люминесценции. Добавка аликвот полученного экстракта к образцам светящегося мицелия повышает уровень их светопро-дукции на 1.5—2 порядка и более. Термообработка экстракта, содержащего активатор, в течение 1— 3 мин на кипящей водяной бане не устраняет его стимулирующего действия. Предварительная обработка экстрактов частицами детонационных наноалмазов (полифункциональный адсорбент для связывания белковых и пептидных компонентов) также не устраняет их стимулирующего действия. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что выявленный компонент, вероятнее всего низкомолекулярное, термоустойчивое соединение, которое может являться эмиттером или регулятором люминесцентной системы изучаемого вида гриба. Дальнейшие исследования будут направлены на выделение обнаруженного активатора и изучение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.
Источник