Отделение, очистка и модификация продуктов биосинтеза
Выделение целевого продукта является завершающей стадией биотехнологического процесса. Возможны три варианта образования продукта, которые влияют на выбор способа его выделения:
- • продукт биосинтеза накапливается в клетке;
- • продукт биосинтеза выделяется в культуральную жидкость;
- • продуктом является сама биомасса.
В первом случае клетки отделяют от жидкости, клетки дезинтегрируют (разрушают), а затем очищают продукт от массы разрушенных клеток.
Во втором случае выделение очень облегчается, когда продукт выделяется (экскретируется) в культуральную жидкость.
Для выделения и очистки индивидуального химического продукта применяют разные методы в зависимости от природы вещества.
Например, ферменты протеазу, целлюлазу и другие выделяют путем осаждения органическими растворителями или сульфатом аммония. Эти ферменты по характеру их применения не требуют полной очистки. Но зато эндо- и экзонуклеазы, а также лигазы для генной инженерии требуют тончайшей поэтапной очистки и разделения.
Традиционные процессы третьего типа вообще не требуют отделения продукта.
Отделение биомассы от культуральной жидкости
Разделение жидкости и биомассы называется сепарацией. Предварительно может потребоваться изменение pH, нагревание, добавление коагулятов белков и др. Методы сепарации различны.
1. Флотация. Метод используется, когда клетки не смачиваются жидкостью и собираются (концентрируются) в пене. Во флотаторах жидкость вспенивают и собирают верхний слой пузырьков газа с прилипшими клетками путем сцеживания, откачивания или соскребыванием.
Метод экономичен, производителен, пригоден для непрерывных процессов.
2. Фильтрация. Все известные на сегодня фильтры действуют по единому принципу — задержание биомассы на пористой фильтрующей перегородке. При этом размер пор не играет особой роли. Если поры больше размера клетки отделение идет плохо только в начале. Затем клетки прилипают к стенкам пор, образуют скопления, которые утолщаются и скорость протока падает.
Слой биомассы, забивающий поры, можно удалять автоматически. Биомассу сдувают сжатым воздухом либо срезают ножом (на барабанном вакуум-фильтре, рис. 3.3).
Существуют фильтры однократного и многократного периодического использования. Мембранные, например, тефлоновые фильтры позволяют фильтровать очень разбавленные суспензии. Чтобы они не повреждались при срезании или сдувании, их покрывают гидрофильным слоем, который предотвращает прилипание белков (коллоидов) к мембране.
3. Центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц действием центробежной силы.
Это оборудование дорогостоящее. Оно может окупаться в следующих случаях:
- • суспензия фильтруется медленно;
- • необходимо максимально освободить жидкость;
- • необходимо наладить непрерывный процесс.
Рис. 3.3. Принципиальная схема фильтрования суспензии на барабанном вакуум-фильтре:
1 — корпус; 2 — барабан; 3 — перегородка; 4 — осадок; 5 — трубка для соединения секций с поверхностью головки; 6 — подвижная головка фильтра, на которой натянуты сетка и фильтровальная ткань; 7 — форсунки для разбрызгивания воды; 8 — нож для снятия осадка; 9 — мешалка для взмучивания суспензии
Иногда применяют фильтрационные центрифуги, где фильтрование сочетается с центрифугированием. Широко используются центрифуги без фильтрации. Применяются различные конструкции. Наиболее перспективны центрифуги-сепараторы, где биомасса оседает, например, на стенках вращаемого цилиндра.
Источник
Практическая часть
На аналитических весах взвешивают пустые бумажные фильтры, предварительно высушенные до постоянной массы (вес записывают), и вставляют в воронки. Колбу открывают, и содержимое фильтруют через фильтр. Отделенная от культуральной жидкости биомасса гриба является материалом для определения массы сухого мицелия. После фильтрования замеряют объем культуральной жидкости и доводят до 100 мл дистиллированной водой.
2. Определение массы сухого мицелия
Фильтры с биомассой гриба помещают в сушильный шкаф при температуре 130С на 40 мин (до полного высушивания). Затем фильтры переносят в эксикатор для охлаждения на 10-15 мин, после чего взвешивают на аналитических весах. Разность между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой сухого мицелия (Х), образовавшегося за период культивирования гриба в термостате:
Х = Мм — Мф , (2.1)
где Х – масса сухого мицелия, г;Мф— масса пустого фильтра, г;Мм— масса фильтра с высушенным мицелием, г.
По какому принципу различается стадия выделение целевого продукта?
Что такое центрифугирование ?
Основные процессы отделение и очистка продуктов?
Лабораторная работа № 8 Тема: Изучение ферментативной активности (бродильной, протеолитической, целлюлозолитической) микроорганизмов.
Цель работы: Ознакомиться с биохимическими свойствами микробов.
Просмотреть посевы предыдущего занятия, описать колонии на агаре в чашках Петри (форма, размер, цвет и т.д.);
Просмотреть под микроскопом окрашенные мазки из тех же колоний;
Произвести пересев изолированных колоний на МПБ, МПА и МПЖ в пробирках для определения биохимических свойств микробов.
Ответить на контрольные вопросы.
Материалы и оборудование: Посевы предыдущего занятия, бактериологические петли, пастеровские пипетки (стерильные), предметные стекла, набор растворов красок для окраски по Грамму, фильтровальная бумага, микроскопы; пробирки с питательными средами для определения биохимических свойств бактерий (МПА, МПБ, МПЖ среды с углеводами и индикатором Андреде), молоко цельное, лакмусовое, метиленовое, пробирки с бактериальной культурой для посева на эти среды, спиртовые или газовые горелки.
Биохимические свойства микробов обусловлены наличием в клетке различных ферментов, которые производят расщепление и синтез различных химических веществ. Изучение этих свойств микроорганизмов имеет большое практическое значение в технологии многих пищевых производств (молочном, пивоварении, хлебопечении и др.), а также при дифференциации видов микробов.
При изучении биохимических свойств микробов практический интерес представляет определение сахаролитических, протеолитических и редуцирующих свойств.
Сахаролитические свойства микробов. Сахаролитическая способность микробов определяется по ферментативному расщеплению многоатомных спиртов и некоторых углеводов, именуемых сахарами, на альдегиды, кислоты, газообразные продукты (СО2, СН4, и Н2).
Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахар используют специальные жидкие, полужидкие и плотные питательные среды с соответствующими углеводами и индикатором.
Набор жидких или полужидких сред с углеводами и индикатором называют «пестрым» рядом. Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием ферментов растущего микроба использованные сахара расщепляются до продуктов промежуточного распада (кислота). В результате накопления кислоты снижается рН среды, изменяется цвет индикатора и среды. При отсутствии у микроба какого-либо фермента углеводы не расщепляются, рН остается неизменным, индикатор остается в обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется.
Для определения сахаролитической способности бактерий используют чаще всего среды Гиса с индикатором Андреде. Они состоят из пептонной воды, углеводов и индикатора (кислый фуксин, обесцвеченный раствором едкой щелочи). Применяют также полужидкие среды с индикатором «ВР» (водно-голубой краситель, обесцвеченный розоловой кислотой).
Если исследуемая культура микроба под действием фермента разлагает углевод с образованием кислоты, то происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание среды (в розово-малиновый цвет с индикатором Андреде или в голубой с индикатором «ВР»). Кислота вступает в реакцию с щелочью или розоловой кислотой и нейтрализует их.
Если расщепление углевода идет до конечных продуктов, т.е. до СО2и воды, то наличие газа определяется в газовках (если среды жидкие) или пузырьки газа обнаруживают в толще полужидкой среды.
Посевы на углеводные среды (с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, дульцитом и др.) проводят распрямленной в виде стержня бактериологической петлей уколом по центру среды.
Для обнаружения газа в пробирку со средой перед стерилизацией помещают небольшой клочок ваты или маленькую запаянную с одного конца стеклянную трубочку (поплавок). Пузырьки газа задерживаются ватой или собираются в верхнем конце трубочки, вытесняя среду, заполнившую трубку при стерилизации.
Протеолитические свойства микробов. Протеолитические свойства проявляются выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.) и определяют путем посева микробов в желатин, на свернутую кровяную сыворотку и молоко.
При росте в молоке микробы, выделяющие протеолитические ферменты, через несколько дней вызывают пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается растворением сгустка казеина под действием фермента казеиназы, выпадением осадка и просветлением молочной сыворотки.
В посевах на молоке определяют способность микробов свертывать молоко (в результате ферментации лактозы и образования молочной кислоты) и пептонизацию. Если молоко после культивирования микробов не свернулось, его кипятят в пробирке, вынув пробку, так как молоко при кипячении может выбрасываться из пробирки и вызывать ожог. Если после кипячения молоко не свернется, то углевод не разлагается.
Посевы в МПЖ культивируют 5-7 сут при комнатной температуре, так как желатин расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, реповидное, в форме чулка и т.д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, дают в МПЖ рост без разжижения желатина.
В посевах со свернутой кровяной сывороткой протеолитические микроорганизмы также вызывают разжижение, а непротеолитические не изменяют ее консистенцию.
На молочном агаре (смесь водного раствора агар-агара и обезжиренного молока) вокруг колоний протеолитических микробов образуются зоны просветления вследствие разложения казеина. Зоны протеолиза широкие, зоны пептонизации узкие.
Распад белков под действием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, протекает неодинаково: некоторые виды бактерий образуют конечные продукты распада – индол, сероводород, аммиак.
а) Определение индола. Определяют по способности микроба расщеплять аминокислоту триптофан под действием фермента триптофаназы. Предложено несколько методов определения индола. Наиболее часто употребляется метод Эрлиха – Боме. Реактив Эрлиха – Боме: 1 г парадиметиламидобензальдегида растворяют в 95 мл 96 0 спирта и 20 мл НCl(плотность 1,19). К 5 мл 2-3-дневной бульонной культуры добавляют 2-3 мл эфира. Встряхивают и реактив добавляют по стенке. В присутствии индола весь эфирный слой или его нижняя часть окрашивается в красный цвет.
Можно индол обнаружить путем использования индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу пропитывают первым реактивом Эрлиха, затем ее высушивают на воздухе и нарезают на тонкие полоски. Первоначальный цвет пропитанных реактивом Эрлиха бумажек желтый. Хранят индикаторные бумажки в стерильной банке с притертой пробкой. Для определения индола делаю посев в пробирку с МПБ, под пробирку вставляют индикаторную бумажку (нижний конец бумажки не должен прикасаться к среде) и культивируют при 37 0 С в течение 24-48 ч. Если исследуемая культура бактерий разлагает белок с образованием индола, нижняя часть индикаторной бумажки окрашивается в малиновый цвет.
б) Определение сероводорода. Для определения сероводорода производят посев исследуемой культуры бактерий на мясопептонный бульон (с 3% пептона) или пептонную воду. Между стенкой пробирки и ватной пробкой помещают фильтровальную полоску бумажки, пропитанной 10%-ным раствором уксуснокислого свинца. Если засеянные микроорганизмы расщепляют белковые вещества с образованием сероводорода, то полоска фильтровальной бумажки чернеет в результате образования сернистого свинца. К числу микробов, вызывающих расщепление белковых веществ с образованием сероводорода, относятся некоторые виды паратифозной группы бактерий, гнилостные бактерии.
в) Определение аммиака. Присутствие аммиака обнаруживают так же, как и сероводород, но для этого используют лакмусовую бумажку. При наличии аммиака розовая лакмусовая бумажка принимает синюю окраску. К таким микробам относятся флюоресцирющие бактерии, уробактерии и др.
Источник